
對於NIPT而言,胎兒濃度是十分重要的信息。美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)在2016年更新的NIPS聲明中,對胎兒濃度與NIPS(NIPT)檢測效力的討論,建議如下:對於采血孕周符合要求的受檢者,如果發生了胎兒濃度低引起的無法報告結論,建議行診斷檢測,不宜重新采血。應為嚴重肥胖者提供NIPS以外的非整倍體篩查方案。NIPS檢測報告應包含明確的胎兒濃度信息。檢測機構應建立並監控胎兒濃度的分析和臨床有效性。在報告NIPS結果時,對於『無結論(no-call)』的原因,應詳細說明。NIPT面市多年,對胎兒濃度的研究投入不少,方法也層出不窮,性能上嘛,進展是有,但是與理想依然有距離。2017年,關永濤教授領銜的以貝葉斯算法為核心的NIPT數據分析方法,登陸美國 ACMG 會刊 《Genetics in Medicine》。這一方法建立了基於性染色體信息推斷胎兒濃度作為先驗,計算貝葉斯因子判定染色體異常,大幅提高檢測效率的同時,也留下了一個懸而未決的問題:胎兒濃度的估算對於假定的女胎樣本並不是十分理想,這不但限制了NIPT結果准確性的提高,也不便對於性染色體異常情況進行判定。經過近兩年的研究,優迅醫學對於胎兒濃度計算給出了新的思路和新的方法,同樣在《Genetics in Medicine》上刊出。天纔想法的誕生——前人的肩膀如此重要的胎兒濃度,如何更精確的定量,科研人員的嘗試方向緊追研究與技術發展。1、基於Y染色體的方法? 基於PCR定量 Lo et al. Am. J. Hum. Genet. 1998 Zimmermann et al. Clin. Chem. 2005 Lun et al. Clin. Chem. 2008? 基於高通量測序 Chiu et al. BMJ. 2011 Hudecova, et al. PLoS One. 2014 Xu et al. Genetics in Medicine. 20172、基於cfDNA的特點? 基於cffDNA長度 Chan et al. Clin. Chem. 2004 Yu et al. Proc Natl Acad Sci. 2014? 短片段序列在基因組中不均勻分布 Kim et al. Prenat. Diagn. 2015? 核小體定位+ 游離DNA長度 Straver, R. et al. Prenat. Diagn. 20163、DNA甲基化的特性? 胎盤特異性的DNA甲基化 Chan et al. Clin. Chem. 2006 Nygren et al. Clin. Chem. 2010? 全基因組甲基化 Lun et al. Clin. Chem. 20134、SNP位點的特性? 需要母親和父親的基因型 Liao et al. Clin. Chem. 2011 Lo et al. Sci. Transl. Med. 2010? 需要母親的基因型 Jiang et al. NPJ Genom. Med. 2016? 對選定SNP位點的靶向測序 Zhang et al. Nat Med. 2019市面上方法這麼多,英國的一組研究人員(Matthew et al., 2018),對其中一些方法進行了比較發現,基於Y染色體的方法對於男胎胎兒濃度的推斷相對准確,女胎濃度的推斷,各種方法,都遠不及基於Y染色體進行男胎推斷那麼理想。SNP分析染色體濃度的關鍵——雜合性要想突破女胎難題,就得告別性染色體的思路,通過常染色體信息進行分析,纔有突破的希望,優迅醫學同樣把關注點放在了SNP遺傳特點的分析上。之前的報道,有的需要進行額外的靶向富集,有的需要較高深度的測序,兜兜轉轉,方法雖然在改進,但是這對於臨床上作為篩查的NIPT而言,方法雖可行,但是成本上的增加,成為了向臨床轉化的阻礙。在保持較低的測序深度的同時,仍然可以准確分析胎兒濃度的方法,纔是NIPT需要的好方法。可是低深度測序,真的能測到足夠的位點嗎?答案自然是夠的,在低覆蓋度的情況下,依然有相當數量的SNP被超過1條reads所覆蓋。這一點可以根據每個位點處的泊松分布來進行簡單推斷。實際數據中也是一樣的:上表是利用千人基因組項目(1000 genomes project)的數據模擬在不同深度情況下,對SNP覆蓋情況的統計。表? 是千人基因組的統計,表? 是少數基因頻率大於0.01同時出現在1000G和gnomAD中的SNP計數。根據上表,即使在0.2x的情況下,也有1M以上的SNP被兩條以上reads覆蓋,對於這些SNP位點,我們就能定義雜合性了。SNP的雜合性為什麼能推斷胎兒濃度呢,我們做一個天真的假設,假設一個理想的情況,某個SNP位點上基因頻率符合哈代溫伯格定律,所有的測序都沒有錯誤,那麼對於任意一個,有AB兩種鹼基可能性的位點呢,如果A基因的概率是p,B基因出現的概率就(1-p),那麼我們可以把這個位點基因類型的聯合概率分布推算出來假設胎兒濃度是h,就能寫出來每種情況下,測到1個A的概率。如果我們簡單的只考慮覆蓋到2reads的SNP位點的情況,每個位點有AA,AB,BB三種情況,這三種情況發生的概率可以通過上面的表格推算出來就是下面如果我們假設p是標准隨機分布的話,對於剛好測到雜合AB的這個情形,它的概率就可以計算成一個只跟h相關的函數:1/6(1+h-h2),這件事情太美好了,說明能算出來啊。從naive 到 full但是naive 模型說明了,這個思路走的通,所以我們把剛纔過於理想的地方都修整修整。母親的近交系數F1加上,胎兒的近交系數F2加上,測序錯誤e也加上:欲知詳情,請看文獻https://www.nature.com/articles/s41436-019-0636-5(長按二維碼獲取全文)檢驗性能的時刻到了!根據Matthew et al., 2018中所言,對於男胎,通過Y染色體定量是相對准確的,但是女胎樣本的各種方法,都不太令人滿意,因此最好的檢驗方式就是,用男胎性染色體定量方法做比較了。既然對於男胎胎兒我們可以通過Y染色體實現准確的FF定量,那麼我們不妨將我們的新方法與之比一比。圖中是我們回顧了69個真實的男胎臨床樣本得到的數據,兩個數據結果一致性非常棒了,R2= 0.971。偏離的兩個小星星可不是我們的結果不好,反而是結果不要太好,發現了兩個龍鳳胎!(胎兒總濃度是男胎濃度的兩倍)准確推斷胎兒濃度,結合優迅醫學之前建立的貝葉斯方法(Xu et al., 2017)相比較通常使用的Z-score方法,檢測效力(power)有效提高,常染色體准確定量胎兒濃度的方法,給貝葉斯因子的計算提供了可靠的先驗。而貝葉斯方法,允許我們將個體化的先驗信息例如孕婦年齡等情況引入對結果的判斷,避免了采用基於正態分布的常規方法(z-score)在cut-off附近與實際情況擬合度不佳,對准確性的影響。總結:准確定量胎兒濃度對NIPT有三好結合優迅醫學的貝葉斯算法,NIPT結果更准;准確定量胎兒濃度,可以報告濃度過低『no call』而不是報出檢測效力不足的結果,避免可能的假陰性;不依賴性染色體定量胎兒濃度,可以更准確的檢出性染色體的異常。參考文獻Dang M, Xu H, Zhang J, Wang W, Bai L, Fang N, et al. Inferring fetal fractions from read heterozygosity empowers the noninvasive prenatal screening. Genet Med. published online, doi: 10.1038/s41436-019-0636-5Hestand, Matthew S., et al. Fetal fraction evaluation in non-invasive prenatal screening (NIPS). European Journal of Human Genetics 27.2 (2019): 198-202Xu H, Wang S, Ma LL, Huang S, Liang L, Liu Q, et al. Informative priors on fetal fraction increase power of the noninvasivwe prenatal screen. Genet Med. 2018;20:817–824